Ensaio clonogênico (ou formação de colônia)

Ensaio clonogênico (ou formação de colônia)

O ensaio clonogênico ou ensaio de formação de colônias foi descrito pela primeira vez por Puck, Marcus e Cieciura em 1956 durante pesquisas com células HeLa. Este método possibilita análises na viabilidade reprodutiva de células, isto é, analisa a capacidade de uma célula gerar uma colônia de 50 ou mais células. Para isso, são selecionadas células controle e células que foram expostas a tratamentos como, por exemplo, radiação ionizante, agentes citotóxicos e manejo genético. Dessa forma, o ensaio avalia a capacidade de sobrevivência e proliferação celular mediante tratamentos, de modo que se possa investigar a progressão de um tumor, por exemplo. Ademais, esse método é comumente utilizado na hematologia clínica, em diagnósticos, transplantes de medula óssea, para analisar a hematopoiese quanto a patologias, estresse, infecções, câncer e sob ação de drogas, por exemplo. O ensaio clonogênico possui diversos benefícios dos quais podemos citar: (1) não é operado com corantes e, portanto, não gera interações bioquímicas com as partículas em teste; (2) permite a identificação e quantificação de células de mamíferos autorrenováveis oriundas de culturas in vitro e de tecidos preparados ex vivo; (3) não utiliza animais como cobaias. Em questão da metodologia do ensaio clonogênico, cada estudo demandará um delineamento experimental dependendo da linhagem celular a ser utilizada, juntamente com o tratamento a ser testado, sendo necessário revisão da literatura. Em suma, inicialmente é necessária uma nova cultura da célula alvo, estando em condições ideais e meios específicos para seu crescimento.

Esta cultura será tripsinizada e quantificada na câmara de Neubauer, de forma que existam aproximadamente 100 células por poço em uma placa de 6 poços, onde será possível observar células isoladas (ressaltando que os valores podem variar de acordo com a linhagem celular da pesquisa). Cada orifício da placa deve conter em média 2 ml de meio, o qual se manterá até ocorrer a adesão celular na placa. Após este período, todo meio será cuidadosamente retirado e a cultura sofrerá duas lavagens com PBS, substituindo o conteúdo pelo tratamento a ser realizado, que permanece tempo de acordo com o delineamento escolhido e com a sua citotoxicidade anteriormente determinada. Conforme o tempo for finalizado, a cultura será novamente lavada por PBS e novamente preenchida com o meio próprio para cada linhagem. Neste período do experimento é de extrema importância trocar periodicamente o meio de cultura, sendo que o experimento pode permanecer em estufa com condições ideais por até um máximo de 3 semanas, variando de acordo com o crescimento celular e o objetivo a ser testado.

O ideal é que no final do experimento sejam observadas de 20 a 150 colônias isoladas, de forma que as mesmas não se conectem. A seguir, para a observação do teste realizado todo meio deve ser novamente retirado, as células lavadas com PBS e fixadas com a substância de sua escolha (metanol, acetona, etc.). Seguido a isto, utiliza-se um corante para visualização das células no microscópio, o qual geralmente é utilizado o cristal violeta (seguindo o protocolo conforme o corante escolhido). Por fim, é feita a contagem das colônias obtidas para análise dos dados e estatística. O ensaio clonogênico acaba adquirindo uma grande relevância no estudo de células aderentes a fim de verificar viabilidade celular, sendo que sua maior aplicação é no estudo de tratamentos para células tumorais. Tal técnica, por fazer uso do cultivo de células, se torna uma opção frente ao uso indiscriminado de animais em pesquisas científicas. Na área médica o ensaio clonogênico pode ser a chave para se avançar em novos tratamentos e fármacos oncológico, assim como pode ser aplicado em ensaios em áreas como microbiologia e imunologia, por exemplo.

Logo, espera-se que futuramente novas aplicações sejam adaptadas a tal ensaio e que mais pesquisas optem por este modelo frente aos modelos animais. Esta perspectiva é concebível dada a qualidade da metodologia clonogênica e sua ampla aplicabilidade.

Autores: Sergio Pereira Lima Neto, Stéphanne Kellen Bruno da Silva e William Permagnani Gozzi

Revisão e responsáveis da disciplina: Graziela Domingues de Almeida Lima e Amanda dos Santos Lima

Conteúdo gerado a partir da disciplina: Cultura de célula animal e bioensasios

Coordenação do projeto de extensão: Juciano Gasparotto

Referências

ANNUAL Statistics of Scientific Procedures on Living Animals Great Britain 2020 HC 445. [s.l: s.n.]. Disponível em: <https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment

_data/file/1002895/annual-statistics-scientific-procedures-living-animals-2020.pdf>.

BRIX, N. et al. Analysis of clonogenic growth in vitro. Nature protocols, v. 16, n. 11, p. 4963-4991, 2021.

FRANCHI, L. P. et al. Citotoxicidade e genotoxicidade de nanotubos de carbono. Química Nova, v. 35, p. 571-580, 2012.

FRANKEN, N., RODERMOND, H., STAP, J. et al. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat Protoc 1, 2315–2319, 2006. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.339

OLIVEIRA, D. G. de et al. Estabelecimento de linhagem celular de carcinoma pulmonar resistente à Cisplatina: impacto sobre heterogeneidade