Ensaio de MTT

Ensaio de MTT

O ensaio MTT é amplamente utilizado para avaliação da atividade metabólica celular e da funcionalidade das mitocôndrias, entre outras aplicações diversas. Esse método pode ser empregado para determinar a citotoxicidade de substâncias, auxiliando na triagem de compostos farmacologicamente promissores, além de poder ser usado nas áreas de hematologia e histologia. Um estudo publicado pelo Departamento de Biologia da Universidade de Arak empregou o ensaio MTT para realizar uma análise quantitativa da viabilidade de amostras de esperma humano, evidenciando a popularidade e versatilidade do ensaio. O MTT, conhecido como (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), é capaz de penetrar células viáveis e suas mitocôndrias, por conta de sua polaridade positiva, podendo ser metabolizado em formazan.

Essa metabolização é indicativa de uma cultura de células viva e ativa, o que permite medir a citotoxicidade de outros compostos aos quais uma cultura foi exposta a partir do produto resultante. Bioquimicamente falando, quando se trata de células metabolicamente viáveis, sabe-se que há a presença de desidrogenases mitocondriais que reduzem o anel tetrazólico do MTT em cristais de formazan (E,Z-1-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-1,3-diphenylformazan). O MTT é um sal de coloração amarela que, após sua metabolização à formazan, passa a ser púrpura e, por isso, esse é considerado um método colorimétrico.

De modo geral, o ensaio de MTT é realizado em alguns passos, os quais podem sofrer alterações dependendo do estudo que será realizado, variando, por exemplo, nas quantidades de cada substância e na droga objeto de estudo. Primeiramente é necessário preparar uma suspensão com o tipo celular que será estudado, o qual deve ser distribuído em cada um dos 96 poços da placa de cultivo que, posteriormente, será incubada por 24 ou 48 horas, para que ocorra a aderência das células. Depois desse período, é necessário descartar o meio de suspensão e expor as células à droga objeto de estudo, deixando-a nos poços por um período entre 24 e 48 horas. Após isso, a substância deve ser descartada, e as células deverão ser lavadas com um tampão, sendo adicionado o MTT seguido por uma incubação de 3 horas. Após esse período, o MTT deve ser descartado e o Dimetilsulfóxido (DMSO) adicionado para solubilização dos cristais de formazan gerados.

Por fim, a absorbância de cada poço da placa será obtida com o auxílio de um espectrofotômetro de microplacas, o que permitirá ao pesquisador chegar a um resultado sobre a citotoxicidade da droga. A quantificação da absorbância se dá a partir das leituras que o equipamento faz, com base nas diferentes intensidades da cor roxa nos poços da placa, sendo que, quanto mais purpúreo está o poço, mais células viáveis se encontram nele.

Autoras: Ana Luíza de Figueiredo Diniz Bitencourt, Maria Eduarda de Oliveira dos Santos, Pietra Bruna Barbosa Bento e Vinicius Munhoz Barbosa

Revisão e responsáveis da disciplina: Graziela Domingues de Almeida Lima e Amanda dos Santos Lima

Conteúdo gerado a partir da disciplina: Cultura de célula animal e bioensasios

Coordenação do projeto de extensão: Juciano Gasparotto

Referências

Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., & Kempson, I. (2021). The mtt assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences, 22(23).

Berridge, M. V., Herst, P. M., & Tan, A. S. (2005). Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review, 11(SUPPL.), 127–152.

MAGALHÃES, W. L. Es., THÁ, E. L., LEME, D. M. Método de determinação de concentrações não citotóxicas para avaliação da capacidade protetora da lignina contra danos ao DNA. Colombo, Pr: Embrapa, 2018. Disponível em: https://www.embrapa.br/busca-de-publicacoes/-/