Ensaio de migração celular – fechamento de fenda e Transwell – histórico, metodologia e aplicações

Ensaio de migração celular – fechamento de fenda e Transwell – histórico, metodologia e aplicações

A migração celular consiste no movimento de células individuais ou aglomerados celulares de um local para outro e ocorre naturalmente em diversos processos biológicos, como na cicatrização de feridas e durante quadros inflamatórios. Porém, também se trata de uma das etapas para o desenvolvimento de metástase e, por esse motivo, foram desenvolvidos ensaios para avaliar a capacidade de migração de células, como o ensaio de fechamento de fenda e a câmara de Transwell / Boyden. O ensaio de migração “fechamento de fenda”, se trata de uma alternativa barata e fácil de ser aplicada e observada. Esse método pode ser usado em diferentes substratos, como vidro e plástico, revestidos às vezes por colágeno I, colágeno IV, fibronectina ou extrato de membrana basal (BME, geralmente também chamado de Matrigel) para se analisar o desempenho de migração das células estudadas. Esse ensaio consiste em se fazer um “arranhão” no meio de cultura utilizando a ponta de uma pipeta, abrindo-se uma fenda, a partir da remoção de todas as células dessa região. Então, é possível acompanhar através de um microscópio, o avanço das células em direção à fenda, dentro de um período de tempo e assim calcular a taxa de migração dessas células.

A análise é feita através do cálculo da área de migração, e nesse caso, a direção de movimento das células é horizontal e tem como objetivo replicar as migrações coletivas de tecidos epiteliais que ocorrem in vivo. Por outro lado, a câmara de Transwell, atualmente denominada de migração transwell ou ensaio de câmara de Boyden, a técnica mais comum para medir a migração celular in vitro. A geometria da câmara criada por Boyden consiste em dois compartimentos separados por uma membrana, onde as células respondem a um gradiente químico, fazendo com que migrem através dos orifícios da membrana porosa da câmara superior para a câmara inferior. Consiste em dois meios de cultura divididos em duas câmaras que são separadas por uma membrana porosa, a qual permite a migração de certos tipos celulares entre os meios, de forma que as dimensões das células a serem analisadas determinem o tamanho do poro que será necessário. As membranas disponíveis tem diâmetros de 3 a 12 μm e geralmente as células são introduzidas na câmara superior, de modo que atravessam a membrana porosa de forma vertical, no sentido a favor da gravidade. Após essa migração, há duas formas de se quantificar as células que migraram: 1) há uma manutenção na membrana, removendo com um cotonete todas as células que restaram na parte superior da mesma, para assim as células que migraram poderem ser coradas (com hematoxilina, azul de toluidina ou cristal de violeta) e quantificadas e 2) corar as células com corantes fluorescentes e removê-las da membrana porosa por dissociação (usando tripsina) e quantificá-las com um leitor de fluorescência. Essa técnica é aplicada em culturas bidimensionais, utilizando-se como método de quantificação a fluorescência e a contagem de células, como já mencionado.

Para isso, os substratos indicados são o policarbonato e o poli tereftalato de etileno. Desse modo, o método possibilita a replicação, migração celular e quimiotaxia de um modelo in vivo. O ensaio de migração celular em câmara de Transwell ainda é bastante utilizado em pesquisas. As maiores áreas de aplicação do mesmo são nas pesquisas de base do câncer, em pesquisas de desenvolvimento embrionário, imunológicos e de formação de tecidos (como cicatrização de feridas, por exemplo) – na primeira, é justificada pela principal causa de óbitos em pacientes acometidos, a progressão metastática da doença, onde as células migram, invadem e se fixam em outros tecidos. Assim, nesse contexto, o ensaio citado fornece dados que permitem a compreensão da taxa de migração de uma célula in vitro e/ou de responder à quimioatraentes, como novas moléculas candidatas à futuros quimioterápicos, quimiocinas, fatores de crescimento (citocinas, e. g.), lipídeos ou nucleotídeos.

Autores: Albert Hanchuck Pereira, Bárbara Rafaela Ferreira Aio, Emily Rarissa Crisostomo Benedito e Luiz Fernando Ramos

Revisão e responsáveis da disciplina: Graziela Domingues de Almeida Lima e Amanda dos Santos Lima

Conteúdo gerado a partir da disciplina: Cultura de célula animal e bioensasios

Coordenação do projeto de extensão: Juciano Gasparotto

Referências

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JoVE Science Education Database. Cell Biology. The Transwell Migration Assay. JoVE, Cambridge, MA, 2022.
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