Ensaios de invasão e adesão celular: o que é e como são feitos

Ensaios de invasão e adesão celular: o que é e como são feitos

Antes de discorrer sobre o assunto devemos relembrar os componentes da Matriz Extracelular (MEC) para que haja uma base que auxilie na compreensão dos temas que serão abordados adiante. Desse modo, devemos pensar nos fibroblastos, uma importante célula do tecido conjuntivo, responsável por produzir a MEC. Na região extracelular, temos os componentes sintetizados pelos fibroblastos como o colágeno, fibronectina e as proteoglicanas. Isso é importante, porque a cultura celular precisa necessariamente simular características principais que acontecem nos tecidos in vivo durante os ensaios in vitro. Diante disso, o uso do matrigel, extraído da membrana basal de um sarcoma, é uma alternativa para os ensaios de invasão e adesão celular.

No ensaio de invasão celular ou Câmara Transwell, há uma organização particular com quatro estruturas básicas, composta, em sequência, pelo poço da placa (podendo ser de 24, 12 ou 6 poços); um compartimento superior que é o insert com meio de cultura; a membrana de poro com diâmetro de 8µM e, a parte inferior da câmara, onde também há contato com o meio de cultura. Dessa forma e com essa estrutura, os dois conteúdos ficam separados, podendo ocorrer transposição. Seguido todos os passos necessários do protocolo (MTT, determinação da concentração das substâncias e conhecimento do IC₅₀) é possível iniciar o ensaio. Inicia-se dispondo meio de cultura com soro fetal bovino no poço, estimulando a invasão das células por meio de quimiotaxia. Enquanto isso, dentro da câmara (insert), não há soro fetal bovino no meio de cultura, fazendo com que as células sejam atraídas em direção ao meio com soro fetal, ficando então aderidas à barreira de matrigel, produzem enzimas que irão digerir o matrigel, possibilitando sua migração para onde há mais substrato. Um detalhe importante é que apenas as células invasivas conseguem atravessar essas barreiras.

Para revelar o ensaio é necessário retirar o insert, fazer a limpeza das células que não transpassaram o insert, realizar a coloração (como azul de toluidina) e, por fim, realizar a leitura em microscópio invertido com o auxílio do reagente MTT (assim quanto mais escuro o poço mais células viáveis possui). É preciso uma captura da imagem do microscópio para que seja carregada em um programa de contagem e assim, obter o número de células na placa. Com o número de células do controle e do tratado se faz a leitura dos resultados alcançados. Um ponto de extrema importância é checar se a concentração da droga utilizada não mata a célula ao invés de somente interferir nessa aderência. Outro método para realizar o ensaio de adesão é utilizar uma placa de seis poços, fazer o tratamento com TNF-α (2,5, 5 ou 10 ng/ml) ou lipopolissacarídeo (0,5, 1 ou 5 μg/ml), marcar com fluorescência após 12h de tratamento e incubar por 30 min, realizar a lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para a retirada das células não aderidas, depois dissociar, ressuspender em PBS como células únicas e quantificar por fluorescência usando citometria de fluxo. Esse ensaio já foi realizado com células endoteliais da veia umbilical humana para quantificar os monócitos aderidos baseado em citometria de fluxo.

Entende-se que esses ensaios in vitro, ensaio de invasão celular e ensaio de adesão celular, são de extrema importância para analisar situações in vivo e estudar o comportamento de células vivas, contribuindo também para a redução de modelos animais nos estudos. Na realização desses testes são utilizadas células que desempenham papéis específicos, como células da imunidade (macrófagos, monócitos, …), células cancerígenas e células de patógenos, para compreender como ocorre a invasão e a adesão celular dessas células na MEC, além de serem usados para encontrar tratamentos/drogas eficazes em causar apoptose em células de patógenos e células cancerígenas.

Autoras: Carolina dos Santos Brito, Kimberly Silva Souza e Raphaela da Rocha Gaban de Oliveira

Revisão e responsáveis da disciplina: Graziela Domingues de Almeida Lima e Amanda dos Santos Lima

Conteúdo gerado a partir da disciplina: Cultura de célula animal e bioensasios

Coordenação do projeto de extensão: Juciano Gasparotto

Referências

Pijuan, J.; Barceló, C.; Moreno, D.F.; Maiques, O.; Sisó, P.; Marti, R.M.; Macià, A.; Panosa, A. Ensaios de migração celular, invasão e adesão in vitro : da imagem celular à análise de dados. Front Cell Dev Biol. 14 de junho de 2019; 7:107. doi: 10.3389/fcell.2019.00107. PMID: 31259172; PMCID: PMC6587234.

Vincent, V.; Thakkar, H.; Verma, A.; Sen, A.; Chandran, N.; Singh, A. A novel flow cytometry-based quantitative monocyte adhesion assay to estimate endothelial cell activation in vitro. Biotechniques. 2020 Jun; 68(6):325-333. doi: 10.2144/btn-2019-0169. Epub 2020 Apr 14. PMID: 32283953.