Modelo de Co- cultura in vitro de osteoblastos e osteócitos humano primários em géis de colágeno
Modelo de Co- cultura in vitro de osteoblastos e osteócitos humano primários em géis de colágeno
Os osteócitos e os osteoblastos são células que compõe o tecido ósseo. Os osteócitos apresenta a maior porção deste tecido (95%), também é o responsável por gerenciar a homeostase óssea. Os osteoblastos são responsáveis pela síntese da porção orgânica da matriz óssea, além de síntese de osteonectina (que propicia a deposição de cálcio) e osteocalcina (envolvida no controle de mineralização óssea). A interação entre osteoblastos e osteócitos expressam esclerostina e DKK1 inibindo a via Wnt/β- caterina relacionada à regulação da massa óssea através da regulação da diferenciação e função dos osteoblastos, o que o identifica como um potente inibidor do crescimento ósseo.
Objetivo: desenvolver uma co-cultura funcional com condições adequadas para osteócitos e osteoblastos utilizando células primárias humanas, além de identificar as interações entre estes dois tipos celulares.
Materiais e métodos: o estudo acontece através de três abordagens distintas: I – isolamento direto de osteócitos do tecido ósseo por digestão em várias etapas; II- diferenciação de longo prazo de pré-osteoblastos humanos incorporados em géis de colágeno e III- diferenciação de curto tempo de humanos maduros osteoblastos em géis de colágeno. Sendo a última mais eficiente apontada pelo artigo, uma vez que em três semanas produz uma resposta adequada. Enquanto a primeira é lenta e produz poucas células e a segunda leva seis semanas e produz células em excesso, podendo trazer risco de encolhimento do gel. A preparação do gel, por sua vez se trata de ácido de colágeno com células ósseas e com adição de inserções de transwell de 12 poços com poros de 4um de tamanho.
A leitura dos resultados contou com a microscopia de fluorescência, isolamento de RNA e síntese de cDNA e PCR. Dos resultados obtidos deste estudo, quanto à morfologia dos ostócitos observou-se a manutenção de sua morfologia típica, além da expressão de seus marcadores osteócitos como: E11, osteocalcina, PHEX, MEPE, SOSP, e RANKL Em relação à expressão de marcadores de osteócitos também não apresentou alteração significante na presença de osteoblastos. Já os osteoblastos apresentou osteocalcina significativamente aumentada em todas as co-culturas analisadas com osteócitos diferenciados. Os demais marcadores ALPL, BSPII, RANKL de osteoblastos não apresentou alteração na co-cultura in vitro.
Os desafios observados foram as dificuldades de cultivar osteócitos primários, a separação espacial do osteoblasto ao gel de colágeno e ao fato de osteócitos e osteoblastos possuírem meios de culturas diferentes entre si. Até existem estudos sobre o assunto produzidos anteriormente, porém todos foram realizados em células de roedores e e células imortalizadas, este estudo, se torna o primeiro a estabelecer um modelo in vitro com apenas células humanas primárias. como conclusão do estudo, no estágio avançado de maturação, a superexpressão de Runx2 em osteoblastos não conseguiu regular a expressão de osteocalcina. Isso indica que alguns outros fatores são necessários para a regulação da expressão da osteocalcina nos estágios posteriores. Além de os experimentos não mostraram quaisquer efeitos significativos dos osteoblastos na expressão gênica dos osteócitos, porém ainda é possível que esses efeitos existam em uma zona estreita de osteócitos, que está próxima a camada de osteoblastos.
Autoras: Elisângela de Souza Santos Dias e Natalie Lange Candido
Revisão e responsável da disciplina: Graziela Domingues de Almeida Lima
Coordenação do projeto de extensão: Juciano Gasparotto
Referências
Skottke J, Gelinsky M, Bernhardt A, In Vitro Co-Culture Model of Primary Human Osteoblasts and Osteocytes in Collagen Gels. Int. J. Mol. Sci. v.20, n.8, p.1998.
Lin C. et al. Sclerostin mediates boné response to mechanical unloading through antoagonizing Wnt/β- catenin signaling. J. Bone Miner Res. v.24, n.10, p.1651-1661, Oct 2009.